Circulation 单细胞测序提供心肌梗死治疗新方向

导读：
单细胞测序技术自2009年问世以来多次被Nature、Science、Nature Method等学术期刊评价为年度重点技术，因为单细胞技术可以弥补混合测序笼统地对肿瘤组织和微环境细胞进行基因分析（bulk phase sequencing）等缺陷，能够√确到单细胞水平，是生命科学领域研究一大利器。但在2015年以前并没有得到广泛应用，源于技术无法做到高通量检测、成本较高。随着技术的发展和革新，Fluidigm公司的C1平台、BD公司的Rhapsody平台以及10x Genomics平台等技术的出现，特别是2016年10x Genomics商业化平台横空出世，彻底降低了单细胞测序的成本门槛，使得单细胞测序技术能被广泛应用于基础科研和临床研究，特别是对于癌症早期的诊断、追踪以及个体化治疗具有重要意义，引领新一轮生物医学领域的技术革命。

这里小编特地检索了目前关于单细胞RNA测序的文章发表情况，结果总计达到4300+篇，可见单细胞测序技术被广泛使用，特别是2016年以后文章呈井喷式增长，涉及的领域包括胚胎生长发育、肿瘤微环境研究、干细胞分化、疾病药物靶点耐药机制、组织细胞免疫反应、神经学科脑损伤等多方面，几乎可以在所有的生物科学领域利用单细胞测序技术在单细胞水平研究生命机理。说了那么多，我们来聊聊单细胞技术研究成果吧！
Circulation（IF=23.603）刊登了单细胞RNA测序揭示心肌成纤维细胞（CF）亚群表达特征在心肌梗死中的关键作用一文。该文章正是应用scRNA-seq技术检测了带有Col1α1-GFP标记的小鼠，结果显示了CF的异质性并鉴定了新的CF亚群RCF，主要负责心脏损伤后愈合反应，同时找到了心肌梗死后该细胞亚群中一个参与心室重塑过程的关键分子Cthrc1，表明新的细胞亚群参与心肌纤维化过程，并且Cthrc1可以调控该过程从而为心脏相关疾病提供新的治疗途径。

【英文题目】Single-Cell RNA-seq Analysis Reveals a Crucial Role for Collagen Triple Helix Repeat Containing 1 (CTHRC1) Cardiac Fibroblasts after Myocardial Infarction
【中文题目】单细胞RNA测序揭示心肌梗死后CTHRC1在心肌成纤维细胞中的关键作用
【发表期刊】Circulation
【影响因子】23.603
【发表时间】2020.09.25
【DOI】10.1161/CIRCULATIONAHA.119.044557

研究背景

心肌成纤维细胞(CF)在与不同类型的纤维化相关的心室重构过程中发挥核心作用。研究表明，成纤维细胞对心脏损伤的反应并不均匀。由于真实成纤维细胞标记物是有限的，成纤维细胞群体异质性对心脏损伤的反应仍缺乏恰当的表征。本研究的目的是确定心室重构过程中CF的异质性以及调节其功能的潜在机制。

材料与方法

材料：7079个正常的CF；10,448 个7dpi；8,337个14dpi;6,805个30dpi；
方法：单细胞转录组测序（scRNA-seq）、ATAC-seq、RNA-seq

研究结果

1.单细胞测序表征心肌成纤维细胞异质性图谱
为了跟踪心肌梗死（MI）过程中CF群体细胞的动态变化，文章使用Col1α1-GFP标记的小鼠，通过荧光定位和流式细胞分选检测出CF具有GFP + /CD31 – /CD45 – 表型，并且心肌梗死后GFP + 细胞在梗死区(IZ)和边缘区(BZ)百分比和总数都增加了，显然GFP + /CD31 – /CD45 – 的细胞表达与经典的CF转录组谱一致，表明心脏的GFP +细胞是真正的成纤维细胞，验证了Col1α1-GFP模型小鼠可用于研究心脏修复过程中的CF生物学。
为了进一步表征心肌成纤维细胞在单细胞水平心肌梗死后的动态变化，本文分选出GFP + CF作为单细胞转录组分析研究对象，利用单细胞转录组测序一共检测了29,176个细胞，通过转录组表达分析鉴定了10个心肌成纤维细胞亚群（A-J簇），其中K簇是一个经典的周皮细胞标记物高表达群体，B，D，I和J簇显示特定的表达谱，代表潜在的功能CF亚群，而其余簇（A，C，E，F，G和H）显示出较少的转录组特征，很可能是反映较大人群中的中间CF类型。同时与近期CF 单细胞转录组测序数据相比较，GFP+ CF都在证实CF范围内。

图1. scRNA-seq揭示心肌成纤维细胞的异质性

2. 新CF亚群的鉴定-RCF

为了进一步探寻不同簇在MI过程中的潜在作用，作者通过分析不同簇细胞百分比的变化，发现F、H和K簇细胞百分比在不同时间点保持不变，而B簇在MI前后GFP+细胞百分比出现了明显的变化，在健康的心肌中只有2.3%的GFP+细胞属于B簇，MI后百分比急剧上升(7dpi为12%，14dpi为34%)，随后在30dpi下降到12%。通过KEGG和GO功能预测富集分析，与其他簇相比发现B簇转录组基因显著性富集在细胞外基质组织、细胞增殖、细胞基质粘附相关信号通路中，明显B簇细胞转录组涉及到结构性（Fmod、Comp）和胶原代谢(Ddah1、Lox、Ptn)相关的基因，而且通过鉴定发现Cthrc1可以作为B簇*显著性标志性分子，该基因主要参与血管重构和纤维化过程，并且B簇ECM相关基因高度特异性表达，表明B簇与纤维化过程密切相关。免疫组化分析B簇标志物分子Cthrc1, Ddah1和Fmod在7,14,30dpi的IZ和BZ区域都存在，同时利用RNAseq表达谱分析发现心肌梗死7dpi也存在B簇的表达特征。通过以上实验，作者定义B簇为CF一个亚群，其特征有：1）在MI过程中出现；2）呈现显著的动态纤维化；3）定位在受损的组织中。通过拟时序分析发现Cthrc1几乎只在B簇细胞中表达，而其他的一些活化CF标记基因如Postn、 Acta2/αSMA在激活的早期阶段表达，这也就预示着B簇成纤维细胞是MI反应中产生的Postn + CF亚群的最终激活阶段。

为了确定B簇细胞和其他活化的CF亚群之间的差异，作者比较了特异性表达Postn(活化的CF)、Acta2 (基质纤维细胞)和/或Cthrc1 (B簇成纤维细胞)的CF的转录组谱。根据这三种标记的联合表达，会出现不同的活化CF亚群。总的来说，这些结果表明B簇细胞代表了一个特定的活化的Postn + CF亚群，在修复心脏纤维化过程中起主要作用。因此,作者将这些细胞亚群定义为修复心肌成纤维细胞(RCF)。

图2. 新CF细胞亚群的鉴定

3. RCF形成的分子调控机制的探索
文中采用经典的联合组学方法研究RCF形成的分子机制。首先通过ChiP-seq数据挖掘RCF相关基因的转录因子，发现SOX9能与多个RCF标志分子结合，而且SOX9过表达能够诱导CF产生23%的RCF，这表明了SOX9可以参与CF的激活并促进RCF的形成。为了进一步证实TF调控RCF的形成，作者利用ATAC-seq检测了处于7dpi时的CD200 + /CD146 -（RCF）和CD200 – /CD146 以及不同时期 的GFP + CF，结果表明RCF具有*高的染色质可及性。Motif分析进一步表明RUNX1、SMAD等可作为RCF的调节因子，通过差异分析表征了调节RCF形成的三类特征TF；同时构建蛋白信号传导和基因调控互作网络图分析显示RCF相关基因的表达是通过非典型的TGF-β1/PI3K-Akt信号通路驱动的。而TGF-β1特异性抑制剂SMAD2/3和非特异性抑制剂AKT 、 p38都减少了ECM（Col1α1, Col3α1, Lox）和CF激活相关基因(Cthrc1, Ddah1, Postn, Acta2)的表达。这些结果表明，RCF的纤维化激活和表型转化受SMAD2/3和AKT/p38的平衡调控。值得注意的是，TGF-受体1/ALK5 的特异性抑制剂SB -43154只调控Acta2和Col1α1，但不调节Postn和Col3α1。

图3.RCF形成分子调控机制

4. CTHRC1调节RCF损伤愈合修复的活性

作者观察到Cthrc1只在CF中而不在其他心肌细胞中表达，因此想要探讨Cthrc1在CF中的功能作用。文中通过Cthrc1敲除小鼠（KO）研究发现在生长发育成年过程中大小、体积、心脏表型都没有太大的变化，但是心肌梗死后KO小鼠的存活率显著下降（80% WT vs 30% KO），这与KO梗塞心脏左心室游离壁胶原沉积的显著减少有关。GO富集分析发现，与WT相比较，KO CF在MI 涉及到细胞分化、增殖以及蛋白合成信号通路富集有显著性差异，并且通过TGF-β1诱导的KO CF在血管生成、肌肉收缩、血管系统发育等相关通路基因明显下调，表明KO CF对TGF-β1反应调控能力降低。单细胞RNA测序进一步分析了4189个处于7dpi的KO CF，与WT相比较，RCF类的细胞百分比增加了（21% KO vs 14 WT）。RCF类的CF和其他活化CF的亚群（如POSTN +）都在Cthrc1-KO梗死小鼠的IZ和BZ中被发现了，这也就说明了心室破裂的表型来源于CTHRC1 的缺失。因此，Cthrc1的缺失与ECM组织、胶原生物合成和TGF-介导的调控有关的基因下调密切相关。这也证实了RCF通过分泌CTHRC1介导心脏修复影响ECM分子的沉积和合成，促进CF的增殖。

图4. CTHRC1是RCF在愈合修复过程中的重要效应因子

5. 临床RCF表达特征图谱验证

为了进一步评估RCF细胞群的表达特征图谱，分别在临床模型猪和人心肌成纤维组织中进行验证，均表明可以在MI过程中检测到RCF，并且CTHRC1 表达的细胞只存在心肌梗死区（IZ）。最后，在缺血性心肌病患者的缺血区(IZ)和扩张型心肌病(DCM)患者的左右心室活检中，部分发现了RCF的转录特征。与对照组相比，RCF转录组特征的几个基因(CTHRC1、PTM、FMOD)在本研究的所有病理条件下均显著过表达。此外，CTHRC1 + CF在患者梗死心脏的IZ中发现，而在RZ中没有发现。这些发现强调了CTHRC1 + RCF在指挥心脏纤维化患者心脏修复过程中的潜在作用。

图5. RCF标志物的表达在心肌梗死模型猪和人中的验证

总结

综上所述，本文巧妙地利用了scRNA-seq、RNA-seq以及ATAC多组学联合技术，表征大量的CF细胞亚群，揭示了在MI后CF的显著异质性，并定义了一个具体以Cthrc1表达为特征的亚群-RCF；充分表明了Cthrc1+ CF在心肌梗死后早期愈合过程中的作用，这些新发现为患者心脏纤维化过程进行治疗提供了新方向。