CDD︱单细胞转录组测序技术助力鲁明/胡刚团队发表新成果

2024年11月，南京医科大学基础医学院药理学系鲁明教授、胡刚教授团队在Cell Death & Differentiation发表题为”Dural Tregs Driven by Astrocytic IL-33 Mitigate Depression Through the EGFR Signals in mPFC Neurons”的研究论文，使用单细胞转录组测序技术等多种技术，深入阐述小鼠硬脑膜免疫细胞的抗抑郁机制，为抑郁症治疗提供了新的潜在治疗靶点。接下来是本文的详细解读。

文章标题：Dural Tregs Driven by Astrocytic IL-33 Mitigate Depression Through the EGFR Signals in mPFC Neurons

期刊名称： Cell Death & Differentiation

影响因子：13.7

合作单位：南京医科大学基础医学院药理学系

研究对象：小鼠

百迈客生物为该研究提供了10X单细胞转录组测序技术服务。

研究背景

抑郁症是一种常见的精神障碍，表现为长时间情绪低落、失去快乐或对活动的兴趣等，其表现不同于正常的情绪变化和对日常生活的感觉。抑郁症具有发病率高、临床治愈率也高，但治疗接受率低、复发率高的特征，目前治疗手段有限，约有30%患者接受一线抗抑郁药物后症状无缓解，症状有缓解的部分患者会在首次治疗后复发。因此，有必要深入研究认识抑郁症的生理病理致病机制，为开发更有效的治疗手段提供见解。

材料及方法

材料：8周大C57BL/6雄性小鼠以及6个月大ICR小鼠，构建慢性社交挫败应激（CSDS）模型。不同基因型小鼠（Il33-/-，Il1rl1-/-，Rag1-/-，Foxp3DTR）购买后，培养1周后再进行实验。

方法：单细胞转录组测序，免疫荧光，RT-PCR，ELISA，Western blot，流式细胞术，细胞实验，动物实验等。

研究结果

• 抑郁应激诱导小鼠出现显著的硬脑膜Treg扩增

研究者首先构建CSDS小鼠模型并经过行为学实验验证，采用流式细胞术等研究CSDS小鼠硬脑膜-脑界面免疫细胞，发现Treg（调节性T细胞）在硬脑膜而不是脑实质中显著增殖激活，fluoxetine（抗抑郁药物）显著激活硬脑膜Treg扩增，这些结果暗示Treg可能在抑郁样行为发展中起到重要作用，fluoxetine可能通过增加硬脑膜中的Treg减轻抑郁表现，调控硬脑膜Treg或许是治疗抑郁的潜在靶点。

• 定义硬脑膜Treg免疫表型

CSDS小鼠和对照组小鼠硬脑膜分选得到的免疫细胞进行scRNA-seq，结果显示CSDS小鼠硬脑膜T细胞占比增加，其中Treg和Th17比例增加，Th2比例降低，初始T细胞没有发生变化；Treg中，Gata3+ Treg比例提高，初始Treg和Rorx+ Treg比例降低。对照组小鼠硬脑膜和脾脏分选得到Treg进行SMART-seq，发现与脾脏相比，硬脑膜Treg的Gata3+亚型和Rora+亚型相关基因表达上调。流式细胞术进一步证实CSDS小鼠硬脑膜中GATA3+ Treg显著增加，RORγt+ Treg数量无显著变化。这些表明GATA3+ Treg可能参与抑郁表现的调控。

• IL33/ST2信号参与CSDS应激后硬脑膜中Treg增加

SMART-seq数据显示CSDS小鼠硬脑膜“IL33结合”以及其他内源性分子结合信号通路表达上调；与脾脏相比，CSDS小鼠硬脑膜中表达ST2的细胞比例显著高于脾脏；硬脑膜Treg富集趋化性通路。scRNA-seq数据也显示CSDS小鼠模型中T淋巴细胞聚群高表达ST2编码基因，且表达水平高于对照组小鼠的T淋巴细胞；CSDS小鼠模型硬脑膜Treg高表达ST2编码基因。随后，研究者将WT小鼠和Il1rl1-/-小鼠硬脑膜Treg细胞转移到Rag1-/-小鼠并构建CSDS模型，行为学等实验结果证实，ST2表达是硬脑膜Treg招募和扩张所必须的。IL33-/-小鼠相关实验也支持了IL33/ST2信号在抑郁期间促进硬脑膜Treg增殖。

• mPFC星形细胞IL33介导了硬脑膜Treg的浸润

mPFC、海马、脑脊液等组织的ELISA、qPCR以及Western blot实验结果表明，CSDS小鼠硬脑膜ST2+ Treg激活所需的IL33来源于脑实质而不是硬脑膜。多重免疫荧光结果表明mPFC处星形细胞是IL33增加的主要贡献细胞类型。进一步的特异性细胞类型IL33基因表达KO-恢复实验及相应的行为学实验、流式细胞术等结果表明，主要是星形细胞来源的IL33介导了CSDS小鼠中硬脑膜Treg的产生。

• 通过增强AREG分泌，硬脑膜Treg抵消了抑郁应激

进一步分析scRNA-seq数据发现T细胞簇还显著高表达Areg，流式细胞术、Western blot、免疫荧光等实验表明CSDS小鼠硬脑膜AREG分泌加强，mPFC区域AREG表达水平显著降低。通过向CSDS应激小鼠脑延髓注释AREG的中和抗体并进行检测，发现CSDS小鼠表现出更严重的抑郁行为。这些结果暗示来源于硬脑膜Treg的AREG可能是抑郁进展中的主要中间物。

• 硬脑膜Treg来源的AREG可以影响CSDS小鼠mPFC的锥体神经元

脑免疫荧光扫描结果表明硬脑膜来源的AREG可能特异性的影响mPFC神经元活性，TSA多重染色等实验结果表明，CSDS应激显著诱导mPFC神经元EGFR（AREG是EGFR配体）的表达，硬脑膜AREG去除可显著抑制mPFC的EGFR激活，小脑延髓池注射的AREG中和抗体只去除了硬脑膜AREG但对mPFC脑区AREG无显著影响。通过这些结果，研究者假设神经元表达EGFR可以接收硬脑膜Treg来源的AREG，并激活EGFR信号，直接影响神经元活性。

为了验证这一假设，研究者使用AAV抑制mPFC锥体神经元EGFR的表达，免疫荧光、Western blot等实验结果表明，敲除EGFR部分地加重CSDS小鼠抑郁表现，应激诱导的抑郁中mPFC神经元EGFR信号起到重要作用，揭示mPFC锥体神经元是硬脑膜Treg来源AREG的靶细胞。

随后研究者使用全细胞膜片钳技术记录CSDS小鼠mPFC锥体神经元的微小兴奋性突触后电流（mEPSC），发现20ng/ml AREG条件下，锥体神经元的mEPSC振幅显著降低但频率没有变化，表明AREG可抑制AMPA受体功能，降低突触后位点数量，进一步降低EGFR+ 锥体神经元的兴奋性突触传递。

综上，研究者推测硬抑郁小鼠脑膜Treg来源的AREG可以通过抑制mPFC锥体神经元的过度兴奋，抵抗抑郁表现。

研究总结

本研究发现硬脑膜Treg在神经响应抑郁刺激中起到重要作用，硬脑膜Treg与mPFC神经细胞通过AREG-EGFR交流，调控抑郁进展。该发现表明硬脑膜Treg可作为减轻抑郁表型的靶点，为开发新型诊疗手段提供了不同思路。