研究背景

色素性視網(wǎng)膜炎（RP)是常見(jiàn)的遺傳性視網(wǎng)膜失明之一，大約2500個(gè)新生兒中有1個(gè)患有視網(wǎng)膜失明，在世界范圍內(nèi)超過(guò)100萬(wàn)人受到影響。到目前為止，RP還沒(méi)有有效的治療方法，仍然是一種具有醫(yī)學(xué)挑戰(zhàn)性的疾病。大約15%的RP是由pre-mRNA加工因子（PRPF）PRPF8、PRPF31、PRPF3、PRPF4、PRPF6和SNRNP200的突變引起的常染色體顯性形式。

pre-mRNA的可變剪接通過(guò)包含不同的外顯子或在mRNA中保留內(nèi)含子，擴(kuò)大了真核基因組的編碼能力，使相對(duì)較少的基因能夠編碼不同的蛋白質(zhì)組。高水平的剪接多樣性發(fā)生在脊椎動(dòng)物神經(jīng)系統(tǒng)。例如，鼠視桿和視椎光感受器有一個(gè)特定的剪接程序，這種特殊的剪接程序主要影響編碼光感受器初級(jí)纖毛和外段組成成分（光轉(zhuǎn)導(dǎo)必需成分）的轉(zhuǎn)錄本。而視網(wǎng)膜色素上皮（RPE）的成熟也需要功能性原發(fā)性纖毛?？偟膩?lái)說(shuō)，這些數(shù)據(jù)表明，對(duì)光感受器特異性轉(zhuǎn)錄本的剪接程序的√確調(diào)控對(duì)視網(wǎng)膜發(fā)育至關(guān)重要，包括那些參與纖毛發(fā)生的轉(zhuǎn)錄本。

PRPF的突變影響剪接體組裝的化學(xué)計(jì)量學(xué)和動(dòng)力學(xué)，導(dǎo)致視網(wǎng)膜功能所需基因的轉(zhuǎn)錄失調(diào)或PRPF突變蛋白的錯(cuò)誤折疊和聚集，從而觸發(fā)光感受器中的凋亡。然而，與PRPF相關(guān)的RP疾病機(jī)制尚不清楚，也不確定RPE或光感受器是否是主要受影響的組織。矛盾的是，雖然PRPF廣泛表達(dá)，但是其突變只會(huì)導(dǎo)致視網(wǎng)膜特異性退化，這就提出了一個(gè)問(wèn)題，為什么視網(wǎng)膜細(xì)胞更容易受到這些剪接因子缺陷的影響。此外，PRPF動(dòng)物模型作為研究對(duì)象時(shí)，要么不能再現(xiàn)人類RP表型，要么僅表現(xiàn)出晚發(fā)性RPE缺陷。

研究結(jié)果

由于人來(lái)源的多能干細(xì)胞（iPSC）可以分化為RPE和光感受器，作者開(kāi)發(fā)了患者來(lái)源的視網(wǎng)膜細(xì)胞作為獨(dú)特的生理相關(guān)疾病模型，以期對(duì)剪接因子RP的分子發(fā)病機(jī)制有新的認(rèn)識(shí)。作者從4名RP11患者iPSC中獲得了RPE和3D視網(wǎng)膜類器官，這些患者的臨床嚴(yán)重程度因兩種PRPF31缺失突變而不同。大規(guī)模轉(zhuǎn)錄組分析鑒定了受PRPF31突變影響的細(xì)胞類型和患者特異性靶基因的異常剪接，提供了剪接因子RP臨床表型的分子特征。以來(lái)源于一名患有非常嚴(yán)重RP的RP11患者的細(xì)胞為材料，作者利用CRISPR/Cas9糾正了其中的PRPF31突變，挽救了分子和細(xì)胞表型，為原位基因糾正的有效性提供了概念上的證據(jù)。

轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析可變剪接

 

致病通路示意圖

事實(shí)上，不僅二代測(cè)序可以研究可變剪接，作為具有無(wú)需打斷、測(cè)序讀長(zhǎng)長(zhǎng)、定性分析等諸多優(yōu)勢(shì)的三代Nanopore，進(jìn)行全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序更是研究可變剪接的利器。2015年，研究人員以果蠅的Dscam1基因?yàn)槔?，?duì)其存在的19008種可變剪切形式，利用MinION測(cè)序儀檢測(cè)到超過(guò)7000種可變剪切形式，而這樣的結(jié)果則是利用NGS的測(cè)序技術(shù)不能獲得的。2017年，研究人員對(duì)單個(gè)的鼠B細(xì)胞進(jìn)行測(cè)序，并經(jīng)Mandalorion分析，鑒定到數(shù)千個(gè)未注釋的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)和終止位點(diǎn)，以及數(shù)百個(gè)可變剪切事件。該研究結(jié)果表明，通過(guò)Nanopore測(cè)序不僅可以識(shí)別復(fù)雜的isoforms，而且還能定量其表達(dá)水平（點(diǎn)擊查看詳細(xì)介紹）。

ONT在醫(yī)學(xué)研究中的應(yīng)用，除了可變剪接之外，還有轉(zhuǎn)錄本變異檢測(cè)、結(jié)構(gòu)變異檢測(cè)、重復(fù)序列變異檢測(cè)、HLA分型、甲基化修飾研究、微生物水平應(yīng)用等，詳情可在我們之前盤(pán)點(diǎn)的“Nanopore三代測(cè)序在醫(yī)學(xué)研究中的應(yīng)用”中查看哦~

北京百邁客生物科技有限公司與牛津納米孔公司（Oxford?Nanopore Technologies，簡(jiǎn)稱ONT）達(dá)成長(zhǎng)期合作。截至目前，百邁客已經(jīng)擁有Oxford Nanopore的MinION、GridION X5和PromethION全套Nanopore測(cè)序儀。

 

參考文獻(xiàn)

Adriana Buskin et al.Disrupted alternative splicing for genes implicated?in splicing and ciliogenesis causes PRPF31 retinitis?pigmentosa.?Nat Commun，2018 Oct 12;9(1):4234.