1. 軟件依賴及安裝

依賴：

• python： 版本9，安裝cv2模塊（4.0以上版本），Cython，numpy，seaborn模塊
• Minimap2
• Samtools：版本2及以上

依賴的軟件需要使用export添加到環(huán)境變量中，以實現(xiàn)流程的調(diào)用。

安裝：在流程目錄下運行以下命令

pip install ./bmk-ocean-stars

2. 輸入數(shù)據(jù)準備

• 測序數(shù)據(jù)：ONT測序fastq數(shù)據(jù)（支持.gz格式）
• 參考基因組數(shù)據(jù)：基因組fa序列文件，gtf文件（包含gene、exon）
• 熒光解碼文件及HE圖片文件

3. 配置文件編寫

配置文件：

## 測序數(shù)據(jù)

FQ /path/to/ont-reads.fastq

## 熒光解碼文件

FLU /path/to/flu_info.txt

## 參考基因組序列、gtf文件

Genome /path/to/ref/genome/fasta

GTF /path/to/ref/gene/gtf

## HE圖片文件

HE /path/to/HE.tif

## 輸出目錄及輸出前綴

OUTDIR /path/to/result/dir/

PREFIX outfile-prefix

### 程序運行線程數(shù)

Threads 8

Link1 TACGT

4. 流程運行

流程說明：

流程分為4個步驟，如下所示：

步驟1：運行GenomeMap，將ONT reads與參考基因組比對。

步驟2：運行MatrixMake，識別barcode、UMI并生成表達矩陣文件。

步驟3：運行AllheStat，處理HE圖片。

步驟4：運行WebReport，得到網(wǎng)頁版報告。

流程參數(shù)：

-c config.txt 數(shù)據(jù)配置文件

-s 步驟選擇，0為運行1-4所有步驟，也可選擇個別步驟單獨運行，多個步驟中間使用“，”分割。

參考命令：

./BSTMatrixONT -c config.txt -s 0

./BSTMatrixONT -c config.txt -s 1,2,3,4

./BSTMatrixONT -c config.txt -s 1,2

5. 結(jié)果文件說明

目錄結(jié)構(gòu)及結(jié)果說明：

outdir/

├── 01.GenomeMap 步驟1運行結(jié)果目錄

│ ├── HXFA2-3.sort.bam 基因組比對bam文件

│ ├── HXFA2-3.sort.bam.bai

│ └── mapping.sh

├── 02.MatrixMake 步驟2運行結(jié)果目錄

│ ├── bam

│ ├── bc_umi_read.tsv barcode-umi-reads數(shù)文件

│ ├── bc_umi_read.tsv.stat

│ ├── cache_raw_expression.pkl

│ ├── filtered_feature_bc_matrix

│ ├── final_matrix 過濾后的matrix文件

│ ├── flu_recognition barcode芯片位置識別目錄

│ ├── HXFA2-3.bc_gene_umi.bc_stat barcode檢測結(jié)果統(tǒng)計文件

│ ├── HXFA2-3.bc_gene_umi.map_stat 比對類型結(jié)果統(tǒng)計文件

│ ├── HXFA2-3.bc_gene_umi.stat barcode-gene-umi對應(yīng)文件

│ ├── raw_feature_bc_matrix

│ ├── reads_cumi.tsv barcode-gene-umi數(shù)文件

│ ├── reads_info.tsv reads相關(guān)信息文件

│ └── web_summary.html 網(wǎng)頁版統(tǒng)計結(jié)果文件

├── 03.AllheStat 步驟3運行結(jié)果目錄

│ ├── allhe

│ ├── all_level_stat.txt 不同水平的spots統(tǒng)計

│ ├── BSTViewer_project BSTViewer軟件輸入數(shù)據(jù)

│ ├── heAuto_level_matrix

│ ├── level_matrix

│ ├── stat.txt

│ └── umi_plot umi count圖片統(tǒng)計圖目錄

├── 04.WebReport 步驟4運行結(jié)果目錄

│ ├── prefix.filelist

│ ├── index.html 網(wǎng)頁版報告html文件

│ └── src 網(wǎng)頁版報告src目錄

└── prefix 收集的基因表達矩陣等文件目錄

├── barcode_pos.tsv barcode類型對應(yīng)的芯片位置文件

├── barcode.tsv 芯片對應(yīng)的barcode類型文件

├── bc_gene_umi.stat.gz barcode-gene-umi對應(yīng)文件

├── bc_umi_read.tsv.gz barcode-umi-reads數(shù)文件

├── features.tsv features.tsv文件

└── matrix.tsv 基因表達矩陣文件