在單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序?qū)嶒?yàn)中，需要從各種樣本中制備單細(xì)胞懸液，針對(duì)不同的樣本類型，如何獲取活性高、完整性好、結(jié)團(tuán)率低的單細(xì)胞懸浮液，是單細(xì)胞實(shí)驗(yàn)成功與否的關(guān)鍵所在。下面就分享從動(dòng)物組織、血液、植物組織三種樣本中獲取單細(xì)胞懸浮液的基本制備方法和注意事項(xiàng)。

一、動(dòng)物組織

動(dòng)物組織由細(xì)胞外基質(zhì)和嵌入細(xì)胞外基質(zhì)的細(xì)胞組成，且細(xì)胞和細(xì)胞之間存在著大量的蛋白質(zhì)，例如增強(qiáng)組織強(qiáng)度和韌性的膠原蛋白、彈性蛋白等；促使細(xì)胞和外基質(zhì)結(jié)合的層黏連蛋白、纖黏連蛋白等。一般需要通過(guò)機(jī)械法或者酶解法得到單細(xì)胞懸浮液。

不同的組織類型需要不同的解離酶混合液，目前常用的有膠原酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶等，將動(dòng)物組織解離成單細(xì)胞懸浮液。根據(jù)具體組織類型選擇對(duì)應(yīng)的酶或酶的組合進(jìn)行解離。

動(dòng)物組織解離需要注意：

1、細(xì)胞離開母體后很脆弱，解離過(guò)程中酶混合液配比、酶濃度、離心速度、孵育溫度、緩沖液等都可能影響細(xì)胞活性。

2、對(duì)于難解離的樣本，需要優(yōu)化解離酶混合液的配比和延長(zhǎng)解離時(shí)間。

3、新鮮的組織才能用于單細(xì)胞懸浮液的制備，若是冰凍動(dòng)物組織建議提取細(xì)胞核。

4、組織解離過(guò)程中，若細(xì)胞碎片過(guò)多，會(huì)大大降低細(xì)胞的捕獲效率。

二、血液樣本

外周血單核細(xì)胞(Peripheral blood monoculear cell, PBMC)中大部分都是淋巴細(xì)胞（包括B細(xì)胞和T細(xì)胞)，以及少部分的自然殺傷細(xì)胞和單核細(xì)胞，而紅細(xì)胞和血小板沒(méi)有細(xì)胞核，而粒細(xì)胞(granulocytes) 包括中性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞，有多葉核，所以不包括在PBMC中。PBMC的制備采用密度梯度離心法，可通過(guò)Ficoll作為密度梯度介，使得不同密度的細(xì)胞在對(duì)應(yīng)的界面處，然后通過(guò)快速離心，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞分離。

圖1. Ficoll分離細(xì)胞的原理效果圖（圖片來(lái)自于網(wǎng)絡(luò)）

制備PBMC需要注意：

1、全血分離人PBMC，血液樣本置于EDTA紫色抗凝管中保存，4℃保存不超過(guò)12h。

2、需緩慢將血液加在Ficoll上層，速度過(guò)快可能會(huì)沖破層界。

3、使用前需要將Ficoll溶液先恢復(fù)至室溫，再進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

4、搜集得到的樣本若還含有大量的紅細(xì)胞，需要進(jìn)行二次裂紅處理。

三、植物組織

近年來(lái)，關(guān)于人和動(dòng)物的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序應(yīng)用越來(lái)越廣泛，植物單細(xì)胞研究相對(duì)滯后且應(yīng)用領(lǐng)域范圍較小。因?yàn)榕c動(dòng)物細(xì)胞相比，植物細(xì)胞多了一層細(xì)胞壁，阻礙了植物單細(xì)胞懸浮液的制備。一般需要通過(guò)酶解法將植物組織制備成原生質(zhì)體，例如用纖維素酶以及果膠酶消化植物細(xì)胞壁的主要成分（纖維素、半纖維素、果膠等）。

原生質(zhì)體制備需要注意：

1、幼嫩的組織，比如根尖、嫩葉等，細(xì)胞壁比較容易被酶消化。成熟或衰老組織需更長(zhǎng)酶解時(shí)間，以便增加原生質(zhì)體的獲得率。

2、為了提高原生質(zhì)體的制備率，建議PH的范圍維持在5.6～6.0。

3、一般選用0.4M的甘露醇穩(wěn)定劑來(lái)維持滲透壓的平衡。

4.對(duì)于一些難制備原生質(zhì)體的植物樣本，可以考慮提取植物細(xì)胞核。

 

最后，制備合格的單細(xì)胞懸浮液/原生質(zhì)體/細(xì)胞核樣本，可以直接通過(guò)百創(chuàng)DG1000單細(xì)胞微液滴系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)高通量的單細(xì)胞精準(zhǔn)捕獲。百創(chuàng)DG1000是基于微流控、油滴包裹和Barcode標(biāo)記等技術(shù)來(lái)實(shí)現(xiàn)高通量的細(xì)胞捕獲。除了儀器以外，百創(chuàng)DG1000還有配套的2×4的獨(dú)立芯片及配套試劑盒。

百創(chuàng)DG1000部分?jǐn)?shù)據(jù)展示

小鼠胚胎：

某魚類食道：

某植物細(xì)胞核：

人PBMC

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