1. 軟件依賴(lài)及安裝

依賴(lài)：

• python： 版本9，安裝cv2模塊（4.0以上版本），Cython，numpy，seaborn模塊
• Minimap2
• Samtools：版本2及以上

依賴(lài)的軟件需要使用export添加到環(huán)境變量中，以實(shí)現(xiàn)流程的調(diào)用。

安裝：在流程目錄下運(yùn)行以下命令

pip install ./bmk-ocean-stars

2. 輸入數(shù)據(jù)準(zhǔn)備

• 測(cè)序數(shù)據(jù)：ONT測(cè)序fastq數(shù)據(jù)（支持.gz格式）
• 參考基因組數(shù)據(jù)：基因組fa序列文件，gtf文件（包含gene、exon）
• 熒光解碼文件及HE圖片文件

3. 配置文件編寫(xiě)

配置文件：

## 測(cè)序數(shù)據(jù)

FQ /path/to/ont-reads.fastq

## 熒光解碼文件

FLU /path/to/flu_info.txt

## 參考基因組序列、gtf文件

Genome /path/to/ref/genome/fasta

GTF /path/to/ref/gene/gtf

## HE圖片文件

HE /path/to/HE.tif

## 輸出目錄及輸出前綴

OUTDIR /path/to/result/dir/

PREFIX outfile-prefix

### 程序運(yùn)行線程數(shù)

Threads 8

Link1 TACGT

4. 流程運(yùn)行

流程說(shuō)明：

流程分為4個(gè)步驟，如下所示：

步驟1：運(yùn)行GenomeMap，將ONT reads與參考基因組比對(duì)。

步驟2：運(yùn)行MatrixMake，識(shí)別barcode、UMI并生成表達(dá)矩陣文件。

步驟3：運(yùn)行AllheStat，處理HE圖片。

步驟4：運(yùn)行WebReport，得到網(wǎng)頁(yè)版報(bào)告。

流程參數(shù)：

-c config.txt 數(shù)據(jù)配置文件

-s 步驟選擇，0為運(yùn)行1-4所有步驟，也可選擇個(gè)別步驟單獨(dú)運(yùn)行，多個(gè)步驟中間使用“，”分割。

參考命令：

./BSTMatrixONT -c config.txt -s 0

./BSTMatrixONT -c config.txt -s 1,2,3,4

./BSTMatrixONT -c config.txt -s 1,2

5. 結(jié)果文件說(shuō)明

目錄結(jié)構(gòu)及結(jié)果說(shuō)明：

outdir/

├── 01.GenomeMap 步驟1運(yùn)行結(jié)果目錄

│ ├── HXFA2-3.sort.bam 基因組比對(duì)bam文件

│ ├── HXFA2-3.sort.bam.bai

│ └── mapping.sh

├── 02.MatrixMake 步驟2運(yùn)行結(jié)果目錄

│ ├── bam

│ ├── bc_umi_read.tsv barcode-umi-reads數(shù)文件

│ ├── bc_umi_read.tsv.stat

│ ├── cache_raw_expression.pkl

│ ├── filtered_feature_bc_matrix

│ ├── final_matrix 過(guò)濾后的matrix文件

│ ├── flu_recognition barcode芯片位置識(shí)別目錄

│ ├── HXFA2-3.bc_gene_umi.bc_stat barcode檢測(cè)結(jié)果統(tǒng)計(jì)文件

│ ├── HXFA2-3.bc_gene_umi.map_stat 比對(duì)類(lèi)型結(jié)果統(tǒng)計(jì)文件

│ ├── HXFA2-3.bc_gene_umi.stat barcode-gene-umi對(duì)應(yīng)文件

│ ├── raw_feature_bc_matrix

│ ├── reads_cumi.tsv barcode-gene-umi數(shù)文件

│ ├── reads_info.tsv reads相關(guān)信息文件

│ └── web_summary.html 網(wǎng)頁(yè)版統(tǒng)計(jì)結(jié)果文件

├── 03.AllheStat 步驟3運(yùn)行結(jié)果目錄

│ ├── allhe

│ ├── all_level_stat.txt 不同水平的spots統(tǒng)計(jì)

│ ├── BSTViewer_project BSTViewer軟件輸入數(shù)據(jù)

│ ├── heAuto_level_matrix

│ ├── level_matrix

│ ├── stat.txt

│ └── umi_plot umi count圖片統(tǒng)計(jì)圖目錄

├── 04.WebReport 步驟4運(yùn)行結(jié)果目錄

│ ├── prefix.filelist

│ ├── index.html 網(wǎng)頁(yè)版報(bào)告html文件

│ └── src 網(wǎng)頁(yè)版報(bào)告src目錄

└── prefix 收集的基因表達(dá)矩陣等文件目錄

├── barcode_pos.tsv barcode類(lèi)型對(duì)應(yīng)的芯片位置文件

├── barcode.tsv 芯片對(duì)應(yīng)的barcode類(lèi)型文件

├── bc_gene_umi.stat.gz barcode-gene-umi對(duì)應(yīng)文件

├── bc_umi_read.tsv.gz barcode-umi-reads數(shù)文件

├── features.tsv features.tsv文件

└── matrix.tsv 基因表達(dá)矩陣文件