什么是PCR？

聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）是一種用于擴增特定DNA片段的分子生物學技術(shù)，類似于DNA的天然復制過程，其原理是DNA聚合酶以單鏈DNA為模板，以特定引物為延伸起點，通過引物與單鏈DNA模板中的一段互補序列結(jié)合，形成部分雙鏈DNA的過程。

PCR標準程序

標準的PCR過程分為三步：

①變性：雙鏈DNA在高溫（90 ℃~96 ℃）熱作用下，雙鏈之間的氫鍵斷裂，形成單鏈DNA。

②退火：系統(tǒng)溫度降低（60 ℃~65 ℃），使得引物可以通過堿基互補配對，結(jié)合于單鏈DNA 上，形成局部雙鏈。

③引物延伸：在DNA聚合酶（在72 ℃左右，活性最佳）的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，按照堿基互補配對與半保留復制原則，合成與模板互補的DNA鏈，完整一次擴增循環(huán)。

這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板，重復大約25~35次變性-退火-延伸循環(huán)過程，能將目的基因擴增放大幾百萬倍。

圖1：PCR擴增原理圖（圖片來源于網(wǎng)絡(luò)）。

PCR反應(yīng)要素

PCR反應(yīng)關(guān)鍵四種試劑，包括模板DNA、引物、PCR buffer、DNA聚合酶。

1.模板DNA

模板DNA種類較多，比如基因組DNA（gDNA），cDNA和質(zhì)粒DNA。不同DNA類型，PCR反應(yīng)需要的模板量也不同。若模板量過高，會導致非特異片段的出現(xiàn)，相反模板量過低會降低擴增效率。

2.引物

PCR產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補的程度，引物設(shè)計的基本原則：

引物長度:

15~30 bp，常用為20 bp左右。

GC含量:

引物堿基GC含量以40~60%為宜，GC過少擴增效率差，GC過多易出現(xiàn)非特異條帶。
引物內(nèi)部/兩個引物之間不應(yīng)出現(xiàn)互補序列，尤其是避免3 ′端的互補重疊。
引物3 ′端的堿基，特別是最末及倒數(shù)第二個堿基，嚴格要求配對，最佳選擇是G和C。

3.PCR buffer

PCR buffer主要為PCR反應(yīng)提供一個合適的酶催化反應(yīng)場所。Buffer中的Mg2+能夠增加PCR的擴增效率、dNTP為反應(yīng)原料、Tris-Hcl在PCR過程中，維持反應(yīng)體系的pH在6.8~7.8之間。

4.DNA聚合酶

DNA聚合酶分為兩種，普通耐熱DNA聚合酶（例如：Taq聚合酶），PCR產(chǎn)物有A尾。以及高保真DNA聚合酶（例如：pfu DNA聚合酶和KOD聚合酶），具有3′-5’外切酶活性可以消除錯配，PCR產(chǎn)物為平末端。

產(chǎn)品推薦

目前百邁客生物公司推出的Biomarker HS DNA聚合酶是一種全新的類似Pyrococcus furiosus來源的突變酶，具有獨特的結(jié)構(gòu)，融合了持續(xù)合成增強結(jié)構(gòu)域，提高了保真度和延伸速度。保真度比Pyrococcus furiosus DNA聚合酶高6倍。

產(chǎn)品特點

1.樣本兼容性強，適合動物、植物的基因組DNA和cDNA，質(zhì)粒DNA。

圖2：分別以人、雞、小鼠、昆蟲、質(zhì)粒、玉米、水稻、番茄的全基因組DNA為模板，擴增長度分別為628 bp、2.5 kb、1750 bp、750 bp、549 bp、300 bp、1.5 kb、1.2 kb的目標片段。M：250 bp DNA Marker。

2.適用于不同GC%含量片段的擴增。

圖3：對不同GC含量（35%~65%）片段進行擴增，可實現(xiàn)高質(zhì)量的擴增。M：250 bp DNA Marker。

3.靈敏度高，可擴增低至10 pg的模板。

圖4：使用Biomarker HS DNA聚合酶，以不同模板量（10 pg、100 pg、1 ng、10 ng、500 ng）人基因組DNA為模板，擴增 628 bp的目的片段，發(fā)現(xiàn)不同模板量都可有效擴增。M：250 bp DNA Marker。

4.特異性強，可擴增10 kb以上的目的片段。

圖5：使用Biomarker HS DNA聚合酶，以不同基因組DNA為模板，擴增長度分別為549 bp、628 bp、1750 bp、2.5 kb、 5 kb、10 kb、13 kb的目的片段。所有片段均可以實現(xiàn)高特異性、高產(chǎn)量擴增。M：λ-Hind Ⅲ DNA Marker。

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