逆轉(zhuǎn)錄（Reverse Transcription）是以RNA為模板，在逆轉(zhuǎn)錄酶的催化作用下，合成RNA/DNA雜合雙鏈，然后水解雜合雙鏈中的RNA，得到互補的單鏈cDNA的過程。得到的cDNA單鏈可以作為擴增模板，合成雙鏈DNA。cDNA的合成可以用與后續(xù)的PCR實驗、qpcr實驗、基因檢測、基因工程等各個領(lǐng)域。

圖1：逆轉(zhuǎn)錄PCR的流程圖(圖片來源于網(wǎng)絡(luò))

逆轉(zhuǎn)錄實驗成功的要素包含：逆轉(zhuǎn)錄酶、主要反應(yīng)組分、引物的選擇、gDNA去除等。

1.逆轉(zhuǎn)錄酶

大多數(shù)逆轉(zhuǎn)錄酶，主要包括以下三種活性：

①逆轉(zhuǎn)錄活性：以RNA為模板，催化dNTP聚合，生成DNA-RNA雜合雙鏈。

②RNase H活性：水解雜合雙鏈中的RNA，得到與RNA互補的DNA單鏈（cDNA）。

③DNA指導(dǎo)的DNA聚合酶活性:以cDNA單鏈為模板，以dNTP為底物，再合成雙鏈DNA。

常見的逆轉(zhuǎn)錄酶包括AMV和M-MuLV逆轉(zhuǎn)錄酶，M-MuLV逆轉(zhuǎn)錄酶具有更高的熱穩(wěn)定性，并且降低了RNase H的活性。

表1：野生型M-MuLV和野生型AMV兩種逆轉(zhuǎn)錄酶性能對比

 

2.單價陽離子

離子條件基本上影響各種模板的轉(zhuǎn)錄效率。K+的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物比Na+較長。對于cDNA長度的最適K+濃度為140-150 mM。

3.二價陽離子

對于反轉(zhuǎn)錄酶活性來說，二價陽離子也是必需的。產(chǎn)生全長cDNA產(chǎn)物的最適濃度是6-10 mM。

4.dNTP

四種脫氧核苷三磷酸(dNTP)的濃度，對于有效合成cDNA是至關(guān)重要的。如果其中只有一種的濃度小于10-50 μM，cDNA的產(chǎn)量將明顯下降。常用的dNTP的濃度為200-500 μM。

5.引物的選擇

逆轉(zhuǎn)錄引物一般包含三種：oligo dT，隨機引物（Random Primer Mix）和基因特異性引物（GSP）?？蛻艨梢愿鶕?jù)個人需求進行選擇。

表2：三種逆轉(zhuǎn)錄引物優(yōu)劣勢對比

6.gDNA 去除

污染性gDNA可能會干擾逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，并導(dǎo)致后續(xù)的PCR實驗、qPCR實驗結(jié)果出現(xiàn)假陽性、高背景或檢測率降低等現(xiàn)象。通常在RNA提取過程中加入合適濃度的DNase I，37?℃加熱10~15 min，去除gDNA干擾。
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百邁客生物公司推出的一款BiomarkerScript II Enzyme Mix逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，包含了BiomarkerScript II逆轉(zhuǎn)錄酶和RNase抑制劑
（鏈接：http://www.cysolarrack.com/technology-services/fanzhuan），里面的重組M-MuLV逆轉(zhuǎn)錄酶，擁有較低的RNase H活性同時兼具較強的熱穩(wěn)定性。與野生型M-MuLV相比，重組M-MuLV逆轉(zhuǎn)錄酶可以在更高的溫度下合成第一鏈 cDNA。該酶在高達48℃時仍具有高活性，強特異性和cDNA產(chǎn)量更高等優(yōu)勢。

表3：野生型和重組型M-MuLV逆轉(zhuǎn)錄酶性能展示

產(chǎn)品組分

表4：BiomarkerScript II Enzyme Mix逆轉(zhuǎn)錄試劑盒組分

性能展示

1.廣泛的樣本兼容性

可兼容不同樣本，包括動物（小鼠、人、雞、鴿子等）、植物（玉米、水稻、番茄等）樣本

表5：分別以不同物種的總 RNA?為模板，逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA。

2.熱穩(wěn)定性強

BiomarkerScript II逆轉(zhuǎn)錄酶是一種重組M-MuLV逆轉(zhuǎn)錄酶，擁有較低的RNaseH活性同時兼具增強的熱穩(wěn)定性。

圖2：以1μl人肝癌細胞RNA為模板，用BiomarkerScript Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit進行逆轉(zhuǎn)錄，得到cDNA產(chǎn)物。再以100 ng cDNA為模板，用Biomarker HS 2× HF Master Mix進行PCR擴增，將得到的產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果所示：擴增條帶單一且產(chǎn)量高。

3.高反轉(zhuǎn)錄酶的活性

該酶在高達48?℃時仍具有活性，而且特異性和cDNA產(chǎn)量更高。較高溫度下進行反轉(zhuǎn)錄，能夠減少RNA的二級結(jié)構(gòu)，增加反轉(zhuǎn)錄的效率。

4.擴增更長cDNA

可擴增長達10 kb的cDNA，用于基因克隆。

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